基因編輯是近年來發(fā)展起來的可以對(duì)基因組完成精確修飾的一種技術(shù)，可完成基因定點(diǎn)InDel突變、敲入、多位點(diǎn)同時(shí)突變和小片段的刪失等。與傳統(tǒng)的TALEN和ZFN技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)更便捷、高效，應(yīng)用也更廣泛，目前該技術(shù)成功應(yīng)用于人類細(xì)胞、斑馬魚、小鼠以及細(xì)菌的基因組精確修飾。然而，基因編輯仍然是非常新穎的技術(shù)。

　　近日，生物谷圍繞基因編輯研究及亮點(diǎn)技術(shù)CRISPR特別采訪了來自北京生命科學(xué)研究所的張昱博士，張昱在基因編輯領(lǐng)域有多年科研經(jīng)驗(yàn)，對(duì)基因編輯及癌癥關(guān)系研究認(rèn)識(shí)深刻。張博士還將在9月26日出席由生物谷主辦的“2014基因編輯研討會(huì)”并發(fā)表重要報(bào)告，屆時(shí)他將為我們帶來更多精彩解讀。以下為本次訪談實(shí)錄。

　　生物谷：能否簡(jiǎn)要說明基因編輯的原理、應(yīng)用領(lǐng)域及研究意義？

　　張昱：遺傳物質(zhì)是一切生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過對(duì)生物體基因組的改變（基因編輯），從而改變遺傳物質(zhì)及其所編碼信息的內(nèi)容或讀取，將會(huì)影響生物體的遺傳和其他生物性狀。這些生物包括低等生物，比如細(xì)菌等微生物；高等生物，比如與人類密切相關(guān)的動(dòng)物和植物；最終也包括人類。

　　可以想象，改變微生物的基因從而可以影響其各種性狀，比如影響其耐藥性，發(fā)酵特性等等；基因編輯可以用于改變農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中動(dòng)物和植物的性狀，比如產(chǎn)量，繁殖等；對(duì)人類基因組的編輯的應(yīng)用由于倫理等原因，現(xiàn)在主要集中在基因修復(fù)方面，即把一些遺傳疾病中出現(xiàn)基因突變回復(fù)到正常，但隨著對(duì)人類疾病的深入研究，基因編輯的方案和目標(biāo)會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大。顯而易見，改變生命的遺傳信息不僅是一個(gè)哲學(xué)理論問題，也有著廣泛的實(shí)踐意義。

　　生物谷：基因編輯涉及哪些技術(shù)？其中，新技術(shù)CRISPR與傳統(tǒng)技術(shù)相比擁有哪些優(yōu)勢(shì)？

　　張昱：上世紀(jì)末基因工程技術(shù)的快速發(fā)展使得基因編輯在微生物尤其是細(xì)菌和單細(xì)胞真核生物（比如酵母）中成為可能，但對(duì)于多細(xì)胞生物，尤其哺乳動(dòng)物基因組的編輯一直由于技術(shù)問題進(jìn)展比較緩慢。一般來說，基因編輯的目的是在基因組的特定位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)可控的改變：比如刪除一段基因的編碼或調(diào)控序列，從而不能產(chǎn)生有功能的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，過去通稱為“基因敲除”；或者用一段外源性或改變的序列代替原有基因序列，通稱為“基因敲入”。傳統(tǒng)的真核生物中準(zhǔn)確基因編輯倚賴同源重組，對(duì)于模式動(dòng)物（比如小鼠），研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞中發(fā)生同源重組的頻率比體細(xì)胞中高，從而可以在其中進(jìn)行基因編輯，進(jìn)而利用干細(xì)胞的特性產(chǎn)生基因編輯的小鼠，這一技術(shù)獲得了2007年的諾貝爾獎(jiǎng)。

　　為了能在體細(xì)胞和多種生物中實(shí)現(xiàn)基因編輯，大量的工作集中在如何提高基因編輯效率，尤其是同源重組效率上。一方面，研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化同源重組的靶向供體可以提高同源重組效率。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)在靶向區(qū)域引入DNA雙鏈斷裂也能夠大幅度提高重組效率。事實(shí)上，這并不奇怪，因?yàn)橥粗亟M修復(fù)是真核生物中DNA雙鏈斷裂的主要修復(fù)方式之一（另一主要修復(fù)方式是同源模版不依賴的非同源性末端連接）。如果在基因組特異區(qū)域引入一個(gè)DNA雙鏈斷裂，但不提供同源重組的靶向供體時(shí)，細(xì)胞可以利用同源染色體進(jìn)行同源重組修復(fù)，也可以利用非同源性末端連接直接修復(fù)。但后者的修復(fù)過程中通常伴有連接處的堿基缺失或插入，因此也可以造成突變。同樣，非同源性末端連接也可以把兩個(gè)分開的DNA雙鏈斷裂連接在一起，從而造成兩個(gè)DNA雙鏈斷裂之間基因片段的刪除；當(dāng)這兩個(gè)DNA雙鏈斷裂位于不同的非同源染色體上時(shí)，將會(huì)造成染色體轉(zhuǎn)位。

　　最近基因編輯技術(shù)的突破主要集中在利用位點(diǎn)特異性DNA斷裂來提高編輯的效率上。在CRISPR之前，已經(jīng)發(fā)展了三代基因組特異剪切的技術(shù)，這些技術(shù)方案的核心是如何實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組特定序列的特異和高效識(shí)別、結(jié)合、和剪切。與第一代利用改造識(shí)別長(zhǎng)DNA序列（12-40nt）的限制性內(nèi)切酶，第二代利用蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合特異性，第三代利用TALEN蛋白的DNA特異結(jié)構(gòu)域相比，CRISPR對(duì)DNA序列的特異結(jié)合利用了CRISPER復(fù)合物中g(shù)uideRNA與靶序列的互補(bǔ)堿基配對(duì)，而不是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與DNA的結(jié)合，同時(shí)對(duì)靶DNA的剪切活性來自CRISPR蛋白內(nèi)的兩個(gè)核酸酶活性域，所以可以說CRISPR是一種全新的基因組剪切技術(shù)。同時(shí)，與以往傳統(tǒng)技術(shù)相比，它具有高特異性，設(shè)計(jì)上更多的自由度，更高的剪切效率，同時(shí)可以被較為方便地導(dǎo)入細(xì)胞。CRISPR技術(shù)僅僅在最近的兩年開始被大量深入研究和優(yōu)化，可以預(yù)見，隨著更深入的機(jī)制和應(yīng)用研究，這一技術(shù)的優(yōu)勢(shì)會(huì)越來越大。

　　生物谷：CRISPR技術(shù)在疾病治療領(lǐng)域取得了哪些進(jìn)展？

　　張昱：基因編輯對(duì)人類疾病治療的研究大部分還處在實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物模型階段，主要有兩個(gè)方面。首先，對(duì)一些由已知單基因突變產(chǎn)生的遺傳疾病，可以把這些突變替換掉，從而恢復(fù)基因的功能。當(dāng)然，這一基因編輯需要發(fā)生在成體干細(xì)胞中，從而編輯后的細(xì)胞可以增殖進(jìn)而取代原有缺陷的體細(xì)胞。目前，對(duì)于一些血液系統(tǒng)的遺傳疾病研究，比如地中海貧血癥、嚴(yán)重免疫缺陷等，已經(jīng)在動(dòng)物模型上取得了很大的進(jìn)展。其次，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)某些基因的失活可以預(yù)防或治療特異疾病。比如，T細(xì)胞上的HIV共受體CCR5發(fā)生突變后將不能被HIV感染，已經(jīng)有臨床實(shí)驗(yàn)利用鋅指酶對(duì)HIV病人T細(xì)胞的CCR5失活，再把這些細(xì)胞重新導(dǎo)回病人，使用CRISPR的類似臨床實(shí)驗(yàn)預(yù)期會(huì)被很快開展。臨床和實(shí)驗(yàn)室中大量使用抑制劑來抑制蛋白的活性，可以預(yù)見基因編輯導(dǎo)致的基因失活將會(huì)代替一部分抑制劑。

　　生物谷：基因編輯研究存在哪些技術(shù)難點(diǎn)？

　　張昱：基因編輯研究的主要技術(shù)難點(diǎn)是如何高效地在體內(nèi)和體外實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的編輯。對(duì)基因組的剪切意味著對(duì)基因組引入DNA損傷，如何避免這些DNA損傷導(dǎo)致有害的和不期待的基因組不穩(wěn)定，比如基因突變和染色體轉(zhuǎn)位等，越來越多地得到重視。同時(shí)，如何降低剪切的脫靶效應(yīng)（off－target）是實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確基因編輯面臨的迫切問題，對(duì)于基因組修飾和剪切的機(jī)制進(jìn)一步研究將提供優(yōu)化的思路。利用基因編輯治療人類疾病時(shí)，盡管發(fā)生基因編輯的頻率已經(jīng)相當(dāng)?shù)馗撸粋€(gè)技術(shù)難點(diǎn)是如何分離出發(fā)生了正確編輯的細(xì)胞。

　　生物谷：相比轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)物，基因編輯產(chǎn)品是不是更容易受社會(huì)認(rèn)可？市場(chǎng)上目前有沒有應(yīng)用基因編輯技術(shù)的成功案例推出？

　　張昱：轉(zhuǎn)基因的一個(gè)主要問題是它在生物體中過表達(dá)了一個(gè)外源性的基因，在倫理上有較大的爭(zhēng)議。基因編輯如果只是對(duì)內(nèi)源基因的功能進(jìn)行調(diào)控，理論上這一調(diào)控是自然存在的。尤其是把突變的基因進(jìn)行修復(fù)而回復(fù)正常功能，倫理上應(yīng)該更容易被社會(huì)接受。目前市場(chǎng)上應(yīng)該還沒有應(yīng)用基因編輯的動(dòng)物產(chǎn)品，但預(yù)期應(yīng)用基因編輯的植物產(chǎn)品應(yīng)該會(huì)很快出現(xiàn)。

　　生物谷：考慮到安全因素，基因編輯技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入市場(chǎng)還要多久？面臨的主要風(fēng)險(xiǎn)是什么？

　　張昱：基因編輯的應(yīng)用主要面臨的問題不僅僅是技術(shù)層面的，而更大一部分來自倫理方面，尤其是對(duì)于人類為應(yīng)用對(duì)象，面臨和干細(xì)胞相似的問題。另一方面，基因編輯對(duì)生物體性狀的可能不良影響也需要進(jìn)行長(zhǎng)期的和系統(tǒng)的研究。